蛋白质纯化方法

含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化

一. 用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因

所需特殊试剂：1M IPTG

1.                将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。

2.                分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB培养液中，37℃通气培养过夜。

3.                取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A₅₅₀＝0.1-1.0）。

4.                对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0mM相同的温度继续通气培养。

5.                在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。

细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。 

6.                将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。

二. 大量表达靶蛋白

1.                取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。

2.                取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液，在2L的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm，通气培养4小时，至对数生长中期。

3.                以预实验确定的最佳IPTG浓度，最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。

4.                收集菌液，4℃，5000g（5500rpm）离心15分钟收集沉淀，－70℃保存。

三. 细菌破碎和蛋白质溶解

所需特殊试剂：

非变性裂解液：50mM NaH₂PO₄ ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑，pH8.0

超声破碎液：50mM NaH₂PO₄ ,300 mM Nacl , pH8.0

1.                每200ml菌液离心所得沉淀以10ml非变性裂解液充分重悬，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mM。

2.                超声破碎细菌，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。工作时间5秒，间隙时间5秒，总时间20分钟（破碎时间一般不宜超过10分钟，菌量不超过1g）。整个超声过程中探头离烧杯底部1厘米为佳，烧杯置于冰浴中。

3.                超声破碎后，取1滴菌液于载玻片上，烤干后用结晶紫染色观察超声破碎是否完全，大肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。破碎不完全可适当延长超声破碎时间。

4.                将细菌破碎液以10000rpm，30分钟，4℃离心，收集上清。用等同于上清体积的超声破碎液重悬沉淀。

5.                分别取10微升上清和沉淀重悬液用于SDS-PAGE检测，以确定是包涵体表达还是上清表达。其余置于－70℃保存。 

四. Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略

（一）若为上清表达

所需特殊试剂：

非变性裂解液：  50mM NaH₂PO₄ ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑，pH8.0

Wash  buffer:    50mM NaH₂PO₄ , 300 mM Nacl ,20 mM咪唑，pH8.0

Elution buffer:   50mM NaH₂PO₄ ,300 mM Nacl ,250mM咪唑，pH8.0 

1.      离心后上清蛋白与Ni-NTA混匀，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时，使之充分混匀结合。为了完全去除杂质，离心两次或离心后用0.4微米微孔滤膜过滤。

2.      将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，速度可稍慢（5－6秒/滴），收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE，看蛋白挂柱情况。

3.      用Wash buffer 洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50－100倍，以便充分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间可以重复数次。因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。

4.      用  Elution buffer 洗柱，用1.5mLEP管收集洗脱液，直至A₂₈₀<0.1。

5.      测定收集的洗涤液和洗脱液的A₂₈₀，选择A₂₈₀变化明显的管取样进行SDS-PAGE，分析组氨酸标签蛋白的分布。根据A₂₈₀和电泳图选择合并A₂₈₀相近的管，弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析，也可以超滤，还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度，可以使用超滤的办法 。收集的蛋白-20℃保存。

说明：只经过Ni-NTA纯化，所得蛋白一般不纯，往往混有杂蛋白。这时可以考虑进一步的纯化措施，比如DEAE,分子筛，疏水层析等。

（二）若为包涵体表达

所需特殊试剂：

细胞裂解液：50mM Tris-Hcl ,100 mM Nacl ,0.5%Triton X-100, pH 8.0

变性裂解液：10mM NaH₂PO₄ ,10mM Tris-Hcl，8M尿素，pH8.0

复性液： 100mM NaH₂PO₄，10mM Tris-Hcl，2 mM还原型谷光甘肽，0.2 mM氧化型谷光甘肽

Wash buffer: 100mM NaH₂PO₄，10mM Tris-Hcl，pH6.3

Elution buffer: 100mM NaH₂PO₄，10mM Tris-Hcl，pH4.5 

1. 将沉淀重悬液缓慢冻融离心，去上清，沉淀重悬于9倍体积的4℃细胞裂解液，每克菌体加入4mg脱氧胆酸，悬液室温放置5分钟，4℃，12000rpm×15分钟。洗涤5次。

2. 每克沉淀重悬于9ml含0.1 mM PMSF，10 mM 2-巯基乙醇，2 mM还原型谷光甘肽和0.2 mM氧化型谷光甘肽的变性裂解液中，调节pH在10.7，室温放置60分钟。

3.  再用盐酸调pH至8.0，室温放置30分钟。

4.  4℃，12000rpm×15分钟离心，留上清待用。沉淀重悬于100微升1×SDS蛋白上样缓冲液中。取10微升上清加10微升2×SDS上样缓冲液，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，分析溶解程度。

5. 稀释透析复性：每毫升上清缓慢加入9毫升6M尿素的复性液中。装入经10 mM NaOH和1.0 mM EDTA煮沸30分钟，蒸馏水洗涤干净的透析袋中。在4℃ 10倍以上体积含有2M尿素的复性液中透析5个小时。

6. 取出透析袋，再放入4℃ 10倍以上体积的复性液中透析过夜。

7. 取出透析袋中的蛋白，测定其A₂₈₀，加入相应体积的Ni-NTA树脂混匀，按与上清纯化相同的方法上柱纯化，但是Wash buffer和 Elution buffer用包涵体纯化的pH递减的缓冲液。 

五．Ni-NTA 树脂的再生（Qiagen公司）

当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色，此时Ni-NTA树脂需要再生后才能使用。

所需试剂：

再生缓冲液：6M盐酸胍＋0.2M乙酸

2％SDS（m/V）

25％，30％，50％，75％的乙醇（V/V）

100mM EDTA,pH8.0

100mM NiSO₄

裂解缓冲液A：

    10mM NaH₂PO₄ +10mM Tris-Hcl +6M盐酸胍, pH8.0

裂解缓冲液B：

     10mM NaH₂PO₄ +10mM Tris-Hcl +8M尿素，pH8.0

步骤如下：

1.      用下列试剂依次彻底冲洗层析柱：

2倍柱体积的再生缓冲液

5倍柱体积的双蒸水

3倍柱体积的2％SDS

1倍柱体积的25％的乙醇

1倍柱体积的50％的乙醇

1倍柱体积的75％的乙醇

5倍柱体积的100％的乙醇

1倍柱体积的75％的乙醇  

1倍柱体积的50％的乙醇  

1倍柱体积的25％的乙醇  

1倍柱体积的双蒸水

5倍柱体积的100mM EDTA

1倍柱体积的双蒸水

2倍柱体积的100mM NiSO₄

2倍柱体积的双蒸水

2倍柱体积的再生缓冲液

2.      2倍柱体积的适当的裂解缓冲液（A或B）平衡Ni-NTA树脂

3.      将再生后的Ni-NTA树脂按1：1的比例保存在30％的乙醇中

 GST-融合蛋白的纯化策略

所需特殊试剂：

   PBS :140mM Nacl ,2.7mM Kcl ,10mM Na₂HPO_4,1.8mM KH₂PO₄

   Elution buffer : 10 mM Glutathione ,50mM Tris-Hcl，pH8.0

1.        离心后上清加入预先用PBS平衡的400微升Glutathione-Sepharose-4B，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时，使之充分混匀结合。

2.        将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，速度可稍慢（5－6秒/滴），收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE，看蛋白挂柱情况。

3.  用PBS洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50－100倍，以便充分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间可以重复数次。因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。

4. 用Elution buffer 洗柱，用1.5mLEP管收集洗脱液，直至A₂₈₀<0.1。若蛋白需求量大，为了洗脱的更干净，可以加大洗脱的体积（如100毫升），这时可以用烧杯收集。

5.  测定收集的洗涤液和洗脱液的A₂₈₀，选择A₂₈₀变化明显的管取样进行SDS-PAGE，分析目的蛋白的分布。根据A₂₈₀和电泳图选择合并A₂₈₀相近的管，弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析，也可以超滤，还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度，可以使用超滤的办法。收集的蛋白-20℃保存。

说明：只经过GST纯化，所得蛋白一般不纯，往往混有杂蛋白。这时可以考虑进一步的纯化措施，比如DEAE,分子筛，疏水层析等。

  DEAE纯化蛋白策略

1. 平衡。在纯化之前，确保离子交换胶床已被平衡。通常用pH8.0的

20mM Tris-Hcl冲洗柱子3-5个柱体积，冲洗速度可以适当快些，比如30-50毫升/小时，直至达到平衡。缓冲液pH要求高于目的蛋白等电点2个左右pH单位。如果某一目的蛋白的等电点为6.5，这时选择pH8.5的

20mM Tris-Hcl缓冲液更为合适。

2. 上样。要求蛋白样品的离子浓度最好低于15 mM，缓冲液pH高于目的蛋白等电点2个左右pH单位，缓慢上样，便于目的蛋白更好的和胶结合。打开蛋白检测系统，在层析图谱上观察上样情况。上样完毕后，用pH8.0的20mM Tris-Hcl冲洗柱子2-3个柱体积，在层析图谱上表现为回到基线位置。上样后的穿过液取样电泳，分析目的蛋白的挂柱情况。同时保存好穿过液，以备挂不上柱子可以再利用。

3. 洗脱。选择合适的Nacl浓度梯度来洗脱，通常用0-500 mM Nacl。如果目的蛋白还没有洗脱干净，则选择更高浓度的Nacl。洗脱缓冲液一般用pH8.0的20mM Tris-Hcl。用收集器收集，6分钟/管（约4-5毫升/管），收集100管。同时在层析图谱上观察洗脱峰的情况。

4. 根据层析图谱上的洗脱峰，取样进行SDS-PAGE，确定目的蛋白所在的管和纯度。选择收集目的蛋白纯度和浓度较好的管，超滤浓缩脱盐。如果纯度还是不好，则考虑其它的方法进一步纯化，比如疏水层析，分子筛等。

5.  再生。依次用0.1M Hcl、ddH₂O、0.1M NaOH、ddH₂O、1MNacl、ddH₂O和pH8.0的20 mMTris-Hcl洗柱，每次洗的体积至少为柱体积的3倍，ddH₂O洗至少5倍。

6.  贮存。一般放在4℃。长时间贮存，建议将胶用20％的乙醇贮存于4℃。

分子筛纯化蛋白策略 

1.  平衡。在纯化之前，确保离子交换胶床已被平衡。通常用pH8.0的

20mM Tris-Hcl冲洗柱子3-5个柱体积，保持流速1滴/10秒，直至达到平衡。

2.  上样。上样前一般要先离心4℃，12000rpm×15分钟，去除杂质成分，防止杂质成分进入柱子而造成堵塞。上样量不能大于10%柱床体积，最好小于5％柱床体积，一般上样量为1－2毫升。上样时由玻棒引流沿管壁加入到凝胶床面上，注意不要将床面凝胶冲起。控制流速1滴/20秒。控制凝胶床界面不能脱水，并控制样品区带尽量狭窄。等到上样刚刚完时再洗脱，一定注意不要让柱子脱水干燥。否则，柱子干了就只有重装。

3. 洗脱。用pH8.0的20 mMTris-Hcl缓冲液洗脱，用部分收集器收集，4分钟/管（约2-3毫升/管），收集约1-30管。同时在层析图谱上观察洗脱峰情况。

4.  根据层析图谱上的洗脱峰，取样进行SDS-PAGE，确定目的蛋白所在的管和纯度。选择收集目的蛋白纯度和浓度较好的管，超滤浓缩脱盐。如果纯度还是不好，则考虑其它的方法进一步纯化，比如疏水层析，DEAE等。

5.  柱子处理。用pH8.0的20 mMTris-Hcl缓冲液冲洗柱子3-5个柱体积，去除杂质。

6.  贮存。长时间贮存，建议将胶用20％的乙醇贮存于4℃。